用總膠原蛋白分析法分析魚(yú)組織中的膠原蛋白
QuickZyme總膠原測(cè)定提供了一種簡(jiǎn)單快速的測(cè)定生物樣品中膠原數(shù)量的方法。本應(yīng)用說(shuō)明為該檢測(cè)方法在魚(yú)類組織中的應(yīng)用提供了指導(dǎo)，并顯示了與HPLC的比較。
介紹
膠原蛋白是脊椎動(dòng)物體內(nèi)豐富的蛋白質(zhì)。在魚(yú)類（魚(yú)）中，膠原蛋白含量約占總蛋白的3%，明顯低于哺乳動(dòng)物（17%）。
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膠原蛋白的含量負(fù)責(zé)魚(yú)片的完整性和質(zhì)地。
魚(yú)類組織中羥基脯氨酸的含量與生境有關(guān)。生活在溫水中的魚(yú)類膠原體的羥脯氨酸水平高于冷水物種，而哺乳動(dòng)
物中的羥脯氨酸水平甚至更高。這些羥脯氨酸水平與該物種膠原蛋白的熔化溫度相關(guān)。
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魚(yú)膠原越來(lái)越多地用于取 代傳統(tǒng)的動(dòng)物膠原來(lái)制備食品、化妝品或藥用明膠。魚(yú)膠原蛋白沒(méi)有宗教反對(duì)，也沒(méi)有與瘋牛病相關(guān)的問(wèn)題。
魚(yú)類組織中膠原蛋白的準(zhǔn)確分析對(duì)于食用魚(yú)類的質(zhì)量控制和優(yōu)化魚(yú)類養(yǎng)殖條件都具有重要意義。雖然膠原蛋白
是魚(yú)類組織中的主要成分，但它是一種難以純化和定量的分子。這部分是由于膠原分子通過(guò)不同類型的交聯(lián)形
成廣泛的網(wǎng)絡(luò)，使得膠原分子不溶性，難以提取。
市用膠原蛋白檢測(cè)的數(shù)量和類型是有限的。
一些可溶性膠原的分析存在，基于膠原分子沉淀染料天狼星紅。然而，這些分析方法似乎不太適用于組織中的膠原蛋白的分析。
廣泛使用的膠原蛋白測(cè)定方法是基于膠原蛋白水解為游離氨基酸，然后使用HPLC或比色法測(cè)定膠原蛋白特異性
羥脯安酸。然而，這些分析方法是費(fèi)力的，耗時(shí)的，并需要特殊的設(shè)備。為了克服這些缺點(diǎn)，我們最近開(kāi)發(fā)了
QuickZyme總膠原蛋白檢測(cè)法，基于相同的酸水解和比色檢測(cè)原理，但更快，更容易，不需要特殊設(shè)備。
在這個(gè)應(yīng)用說(shuō)明中，我們展示了該檢測(cè)方法的優(yōu)化，使其用于測(cè)量魚(yú)類組織中的膠原蛋白的能力。
圖1。總膠原蛋白比色法測(cè)定原理
方法
冷凍羅非魚(yú)魚(yú)片在當(dāng)?shù)爻蝎@得，儲(chǔ)存在-20oC。在使用前，立即將魚(yú)片解凍，并在快速酶總膠原檢測(cè)試劑盒提
供的水解管中稱重約300毫克的組織片。
每300mg組織中加入1.0ml6M鹽酸，并將試管牢固閉合。然后，組織在95oC的溫度控制的熱塊中水解過(guò)夜。水解物
變得非常暗，并含有小的黑色顆粒。冷卻至室溫后，將水解管在13000xg下離心10min。部分顆粒不能沉淀出來(lái)。
小心地取出一部分上清液，盡可能避免轉(zhuǎn)移顆粒。在4M鹽酸中連續(xù)稀釋水解物，稀釋2-256倍。35微升的幾種水
解液稀釋液的樣品根據(jù)說(shuō)明書進(jìn)行總膠原蛋白測(cè)定。
根據(jù)Bank等人的研究，我們也用HPLC方法對(duì)水解物進(jìn)行了分析。
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結(jié)果
水解魚(yú)組織的稀釋曲線在低稀釋時(shí)呈高度非線性，僅在16倍或以上的稀釋中發(fā)現(xiàn)與稀釋的反應(yīng)呈線性關(guān)系（圖2）
。這表明，水解物中含有在高濃度下干擾羥脯氨酸著色反應(yīng)的物質(zhì)。這種干擾在樣品相當(dāng)稀釋時(shí)消失。為了研究
測(cè)定的回收率，在不同的水解物稀釋液中加入固定數(shù)量的羥脯氨酸。低稀釋（稀釋2倍時(shí)10%）時(shí)羥脯氨酸的回收
率很差，但稀釋16倍或以上的溶液與稀釋呈線性關(guān)系。這與魚(yú)的水解物的結(jié)果非常一致。羥脯氨酸在稀釋16倍或
更高時(shí)的回收率約為120%。
圖2魚(yú)水解物稀釋對(duì)總膠原蛋白測(cè)定反應(yīng)的影響。藍(lán)線：魚(yú)水 解物，紅線：魚(yú)水解物中加入150µM羥脯氨酸(Hyp)。上面板2 至256倍稀釋，下面板16至256倍稀釋。從16倍稀釋向下觀察到 與稀釋呈線性關(guān)系
快速酶總膠原蛋白檢測(cè)與HPLC的比較
根據(jù)Bank等人的方法，也用HPLC分析了用于比色總膠原蛋白法測(cè)定的相同水解物
4.
簡(jiǎn)而言之：水解物通過(guò)在快速 mac真空離心機(jī)中蒸發(fā)鹽酸來(lái)干燥。樣品中的氨基酸用OPA衍生，去除過(guò)量的OPA，用FMOC衍生亞胺酸(Pro和Hyp)， 并在HPLC反相柱上進(jìn)行多次稀釋。通過(guò)比較羥脯氨酸峰面積與以同樣的方法水解和衍生化的標(biāo)準(zhǔn)膠原蛋白制劑的 峰面積來(lái)確定膠原蛋白的含量。結(jié)果以每克濕羅非魚(yú)組織的毫克膠原蛋白表達(dá)。
同樣使用HPLC方法，低稀釋的反應(yīng)是非線性稀釋。在充分稀釋后，可以觀察到與稀釋有關(guān)的線性響應(yīng)。這些稀釋
液用于測(cè)定魚(yú)組織中的膠原蛋白。
用快速酶總膠原檢測(cè)發(fā)現(xiàn)每g濕羅非魚(yú)組織4.5mg膠原，與HPLC法發(fā)現(xiàn)的每g濕組織5.1mg膠原很一致。
結(jié)論
魚(yú)水解物含有干擾快速酶總膠原蛋白測(cè)定的因素，因?yàn)檫@是一個(gè)強(qiáng)非線性的 在低稀釋因子下觀察到與稀釋度的關(guān)系，無(wú)論是對(duì)魚(yú)的水解物本身和添加的羥脯氨酸。 當(dāng)稀釋16倍或更多時(shí)，魚(yú)類的反應(yīng)與稀釋度呈線性關(guān)系 水解物和加入羥脯氨酸 水解物和羥脯氨酸的平行線指向良好的回收率和相似 這兩個(gè)樣本的行為。 同樣，HPLC方法在低時(shí)觀察到響應(yīng)和稀釋之間的非線性關(guān)系 稀釋后，至少需要稀釋64倍。 建議在試點(diǎn)試驗(yàn)中確定一個(gè)特定物種的最佳稀釋度。數(shù)據(jù) 這里可以作為設(shè)計(jì)試點(diǎn)的指導(dǎo)。 快速酶總膠原分析非常適合于魚(yú)類組織中的膠原分析使用稀釋水解物。結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)的HPLC方法具有良好的可比性。
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