第一部分：產(chǎn)品描述

品牌（Brand）： Promega

英文名（English Name）： ONE-Glo™ Luciferase Assay System

中文名（Chinese Name）： ONE-Glo™ 螢光素酶檢測系統(tǒng)（亦常被稱為ONE-Glo™ 螢光素酶報告基因均相檢測試劑盒）

貨號（Catalog Number）： E6120

規(guī)格（Size）： 100ml（系統(tǒng)總?cè)萘浚?100ml ONE-Glo™ Luciferase Assay Buffer 以及 1瓶（vial）凍干態(tài)（lyophilized）的 ONE-Glo™ Luciferase Assay Substrate。

預期用途： 本品僅供科學研究使用，不得用于人體診斷、治療或其他臨床程序。本系統(tǒng)專為哺乳動物細胞中螢火蟲（Firefly）螢光素酶報告基因的表達定量而設計，采用均質(zhì)（Homogeneous）的一步法檢測原理。

第二部分：產(chǎn)品概述與背景

在分子生物學、藥理學和生物醫(yī)學研究中，科學家經(jīng)常需要追蹤特定基因在細胞內(nèi)的表達情況。為了實現(xiàn)這一目標，研究人員開發(fā)出了“報告基因（Reporter Gene）"技術。其中，螢火蟲螢光素酶（Firefly Luciferase，簡稱 Fluc）因其催化反應能夠產(chǎn)生強的生物發(fā)光信號，且背景噪音極低，成為了極受歡迎的報告基因工具。

然而，隨著現(xiàn)代藥物篩選和基因組學研究的飛速發(fā)展，科研工作者對實驗通量提出了高的要求。傳統(tǒng)的螢光素酶檢測試劑往往存在諸多局限：例如試劑配制后極不穩(wěn)定、發(fā)光信號衰減過快導致無法完成大規(guī)模連續(xù)讀數(shù)、對細胞培養(yǎng)基中的成分（如酚紅、血清、抗氧化劑等）高度敏感導致假陰性，以及在手工或機械臂加樣過程中極易產(chǎn)生泡沫干擾信號等。

正是為了攻克上述技術瓶頸，Promega 公司依托其深厚的酶工程與生物化學底蘊，研發(fā)推出了 ONE-Glo™ Luciferase Assay System。該系統(tǒng)采用了一種全新的螢光素酶底物化學配方。它不僅大幅提升了試劑在溶解后的物理和化學穩(wěn)定性，還顯著降低了傳統(tǒng)試劑有的刺鼻氣味，并且對常見的實驗干擾因素展現(xiàn)出了優(yōu)異的耐受性。貨號 E6120 作為其 100ml 的中等規(guī)模包裝，極其適合中小型實驗室開展 384 孔板乃至 1536 孔板的高通量篩選工作。

第三部分：工作原理詳解

要深刻理解 ONE-Glo™ 系統(tǒng)的強大之處，我們需要從其底層的生物化學反應機制說起。螢火蟲螢光素酶（Luciferase）是一種分子量約為 60 kDa 的單體蛋白，它能夠催化底物發(fā)生氧化反應，并將化學能轉(zhuǎn)化為光能。

1. 經(jīng)典的兩步發(fā)光機制

在經(jīng)典的螢火蟲螢光素酶反應中，通常需要以下幾種核心底物：D-熒光素（D-Luciferin）、三磷酸腺苷（ATP）、鎂離子（Mg2?）以及氧氣。反應過程主要分為兩步：

• 第一步（腺苷化反應）： 螢光素酶首先催化 D-熒光素與 ATP 結合，生成熒光素-腺苷酸中間體（Luciferyl-adenylate），同時釋放出一分子的焦磷酸（PPi）。

• 第二步（氧化發(fā)光反應）： 在氧氣的存在下，該中間體被氧化生成處于激發(fā)態(tài)的氧化熒光素（Oxyluciferin），當激發(fā)態(tài)的氧化熒光素回到基態(tài)時，便會釋放出一個光子，產(chǎn)生我們?nèi)庋劭梢姷纳锇l(fā)光現(xiàn)象。

2. ONE-Glo™ 系統(tǒng)的化學改良

傳統(tǒng)的商用檢測試劑大多直接使用 D-熒光素作為底物。D-熒光素在水溶液中容易發(fā)生自發(fā)的非酶促氧化，這導致試劑在溶解后極不穩(wěn)定，需要現(xiàn)配現(xiàn)用，且伴隨著強烈的硫醇類刺激性氣味。

ONE-Glo™ 系統(tǒng)則采用了一種 Promega 保護的新型螢光素酶底物。這種底物經(jīng)過特殊的化學修飾，具有以下理化特性：

• 更強的抗自氧化能力： 即使在室溫或含氧環(huán)境中，該底物的自發(fā)降解速率也遠低于 D-熒光素，從而賦予了試劑長期穩(wěn)定性。

• 更低的揮發(fā)性有機物（VOCs）釋放： 極大地消除了傳統(tǒng)試劑令人不適的氣味，改善了實驗室人員的操作環(huán)境。

• 優(yōu)化的酶動力學曲線： 該底物與螢光素酶的結合效率更高，產(chǎn)生的光子流更強，且“輝光（Glow-type）"持續(xù)時間更長（可達 40 分鐘以上），為高通量儀器的連續(xù)讀數(shù)留足了時間窗口。

當 ONE-Glo™ 試劑加入到含有螢光素酶報告基因的細胞樣品中時，試劑中的去污劑成分會瞬間溫和地裂解細胞膜，將細胞內(nèi)的螢光素酶釋放到溶液中。隨后，新型底物在酶的催化下迅速發(fā)生氧化反應，產(chǎn)生與細胞內(nèi)螢光素酶表達量呈嚴格正相關的發(fā)光信號。科研人員只需使用微孔板讀板機檢測發(fā)光強度（Relative Light Units, RLU），即可精準計算出目標基因的相對表達水平。

第四部分：產(chǎn)品核心特點深度解讀

1. 靈活便捷的儲存條件，打破冷鏈束縛

對于常規(guī)的生物酶類試劑，嚴格的低溫冷凍往往是維持活性的手段。然而，ONE-Glo™ 系統(tǒng)在配方設計上實現(xiàn)了突破。數(shù)據(jù)顯示，其溶解后的 ONE-Glo™ 試劑在室溫（約 22°C）下可以穩(wěn)定存放長達 3 周，而在 2°C 至 10°C 的普通冰箱冷藏環(huán)境下更是可以穩(wěn)定保存 3 個月，期間試劑的功能性僅有約 12% 的自然衰減。這意味著研究人員不再需要頻繁地將試劑在冰盒與冰箱之間來回轉(zhuǎn)移，極大地簡化了日常實驗的準備流程，同時也為自動化工作站的全天候連續(xù)運行掃清了障礙。

2. 尊享清新操作環(huán)境，告別刺鼻異味

做過傳統(tǒng)螢光素酶實驗的科研人員一定深有體會，普通 D-熒光素試劑在溶解和反應過程中會釋放出一股濃烈的、類似于臭雞蛋或腐爛蔬菜的揮發(fā)性硫化物氣味。這不僅嚴重影響了實驗室的空氣質(zhì)量，長期吸入還可能對實驗人員的呼吸道造成刺激。ONE-Glo™ 的新型底物從根本上解決了這一痛點，其在整個實驗過程中幾乎不產(chǎn)生任何難聞氣味，為您和團隊提供了一個更加舒適、健康的科研環(huán)境。

3. 抗擾能力，無視混合與分裝誤差

在 384 孔板或 1536 孔板的高通量實驗中，機械臂的分液精度和加樣后的混勻力度很難做到孔與孔之間全一致。某些敏感的發(fā)光試劑在遭遇劇烈震蕩或形成微小氣泡時，發(fā)光信號會出現(xiàn)劇烈波動，導致數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性極差（High CV%）。ONE-Glo™ 試劑展現(xiàn)出了佳的物理耐受性，它對混合和分裝條件的變化極不敏感。無論是在手工操作中稍微搖晃了幾下，還是自動化設備留下了微小的氣泡，其最終的讀數(shù)都能保持高度的一致性和穩(wěn)定性，從而大幅提升了實驗結果的可靠程度。

4. 專為高密度微孔板量身定制

隨著藥物篩選通量的提升，越來越多的實驗室開始普及 384 孔板和 1536 孔板。在這些高密度孔板中，每孔的加樣體積往往被壓縮在幾微升到幾十微升之間，極小的液體體積使得蒸發(fā)效應和熱散失變得尤為顯著。ONE-Glo™ 試劑憑借其獨特的緩沖體系和底物配方，即使在如此小體積、高密度環(huán)境下，依然能夠提供明亮且持久的發(fā)光信號，是開展 siRNA 文庫篩選、CRISPR 全基因組敲除篩選的理想搭檔。

5. 更強的基質(zhì)效應耐受力，弱化假陰性風險

哺乳動物細胞的生長離不開復雜的培養(yǎng)基，而培養(yǎng)基中往往含有酚紅（pH 指示劑）、血清蛋白、各種氨基酸以及抗氧化劑（如維生素C、谷胱甘肽等）。這些物質(zhì)中，酚紅和維生素C恰恰是螢光素酶催化反應的天敵，它們會通過淬滅自由基或直接消耗底物的方式來抑制發(fā)光信號。ONE-Glo™ 系統(tǒng)經(jīng)過特殊優(yōu)化，對這些常見的細胞培養(yǎng)基成分具有高的耐受閾值。研究人員甚至可以在不全移除培養(yǎng)基的情況下直接進行檢測，這不僅節(jié)省了洗板的時間，更避免了因清洗不全或細胞脫落所帶來的數(shù)據(jù)偏差。

第五部分：儲存與運輸條件

為了保證 ONE-Glo™ Luciferase Assay System (E6120) 的最佳性能，請務必嚴格遵守以下儲存與運輸規(guī)范：

1. 未開封的原始試劑儲存

• ONE-Glo™ Luciferase Assay Buffer (100ml, 子貨號 E605B)： 收到產(chǎn)品后，應將其存放于 -30°C 至 -10°C 的低溫冰箱中。若短期內(nèi)（3個月內(nèi)）頻繁使用，也可將其置于 2°C 至 10°C 的普通冷藏室，其功能性變化極小（約 10%）。

• ONE-Glo™ Luciferase Assay Substrate (1 vial, 子貨號 E606B)： 凍干粉狀態(tài)極不穩(wěn)定，必須在 -30°C 至 -10°C 的環(huán)境下避光保存。

2. 運輸條件

本產(chǎn)品在運輸過程中會使用干冰或足量冰袋進行包裝，以確保其始終處于規(guī)定的低溫區(qū)間內(nèi)。

3. 試劑復溶后的儲存（重要提示）

當您將 Buffer 加入到 Substrate 凍干粉中，配制成 ONE-Glo™ Reagent（工作液）后，其儲存條件變得非常寬容：

• 室溫（約 22°C）： 可穩(wěn)定保存 3 周。

• 冷藏（2°C 至 10°C）： 可穩(wěn)定保存 3 個月。

• 冷凍（-20°C）： 不建議反復凍融。一旦復溶，建議在有效期內(nèi)一次性用完或分裝保存。

第六部分：實驗所需材料與試劑配制

1. 實驗所需自備材料

• 表達螢火蟲螢光素酶的哺乳動物細胞（貼壁或懸浮均可）。

• 標準細胞培養(yǎng)體系（含血清的培養(yǎng)基，不含干擾性過高的抗氧化補充劑）。

• 可調(diào)量程移液器及無菌吸頭（如進行高通量實驗，需配備多通道移液器或自動分液器）。

• 適用于發(fā)光檢測的白色不透明微孔板（推薦使用 Corning、Greiner 等品牌的白色底板，以減少孔間信號串擾）。

• 微孔板發(fā)光檢測儀（Luminometer），具備單次讀取或動力學讀取模式。

2. ONE-Glo™ 工作液的配制步驟

• 取出一瓶全解凍（或平衡至室溫）的 ONE-Glo™ Luciferase Assay Buffer (100ml)。

• 將 Buffer 全部倒入裝有 ONE-Glo™ Luciferase Assay Substrate (凍干粉) 的玻璃瓶中。

• 蓋緊瓶蓋，用手輕輕上下顛倒混勻，直至瓶底的白色凍干粉全溶解，溶液變?yōu)槌吻逋该鳡睿ù诉^程通常需要 1 至 2 分鐘）。

• 注意：請勿使用渦旋振蕩器（Vortex）劇烈震蕩，以免產(chǎn)生大量難以消除的泡沫，影響后續(xù)加樣精度。

第七部分：標準實驗操作流程 (SOP)

第一步：細胞培養(yǎng)與模型構建

根據(jù)您的實驗設計，將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染或瞬時轉(zhuǎn)染了螢火蟲螢光素酶報告基因的細胞接種于合適的微孔板中。以 96 孔板為例，每孔接種 1×10? 至 2×10? 個細胞；以 384 孔板為例，每孔接種 5×103 個左右。將細胞置于 37°C、5% CO? 的培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，待細胞貼壁并達到約 70% - 80% 的融合度時，進行后續(xù)的藥物或基因處理。

第二步：施加實驗干預

根據(jù)您的課題需求，向細胞中加入待測化合物（如藥物小分子、siRNA、質(zhì)粒等）或相應的對照溶劑。繼續(xù)培養(yǎng)所需的時間（通常為 6 小時至 48 小時不等，視具體信號響應動力學而定）。

第三步：去除培養(yǎng)基（可選）

如果您使用的是普通的非酚紅培養(yǎng)基，且細胞狀態(tài)良好，您可以直接跳過洗板步驟，帶著培養(yǎng)基進行第四步。但如果您的培養(yǎng)基中含有高濃度的干擾物質(zhì)，或者您追求低背景，可以使用移液器小心吸走舊培養(yǎng)基，并根據(jù)需要加入 20µl 至 50µl 的新鮮普通培養(yǎng)基或 PBS。

第四步：加入 ONE-Glo™ 檢測試劑

將配制好的 ONE-Glo™ Reagent 平衡至室溫。按照與孔內(nèi)原有液體體積 1:1 的比例加入檢測試劑。例如，如果孔內(nèi)留有 100µl 的培養(yǎng)基，則加入 100µl 的 ONE-Glo™ Reagent。如果是無培養(yǎng)基的干孔，則直接加入 100µl 試劑。

• 小型實驗： 使用多通道移液器快速加入。

• 高通量實驗： 使用自動分液器（如 Multidrop™）設定好流速和體積進行分裝。

第五步：輕晃混勻與孵育

加樣完畢后，使用微孔板振蕩器（Orbital Shaker）以中等轉(zhuǎn)速（約 300-500 rpm）輕晃微孔板 2 至 5 分鐘，確保裂解液與細胞充分接觸并使酶促反應達到平衡。或者，如果您使用的是可自動振蕩的讀板機，也可以在進艙前手動混勻。

第六步：檢測發(fā)光信號

將微孔板放入微孔板發(fā)光檢測儀中。設置儀器參數(shù)：通常不需要設置激發(fā)光濾光片（因為螢光素酶是生物發(fā)光，不需要激發(fā)），發(fā)射光檢測范圍設為全波長或 550nm - 600nm。建議積分時間設置為 0.5 秒至 1 秒每孔。記錄下各個孔位的相對發(fā)光單位（RLU）數(shù)值。

第八部分：本產(chǎn)品解決的實驗痛點剖析

在過往的科研實踐中，許多實驗室在使用傳統(tǒng)螢光素酶檢測系統(tǒng)時，常常陷入以下困境，而 ONE-Glo™ 正是為解決這些問題而生：

• 痛點一：試劑“見光死"，半衰期太短

 傳統(tǒng)試劑溶解后必須在幾個小時內(nèi)測完，否則信號驟降。ONE-Glo™ 打破了這一問題，其長達數(shù)周的室溫穩(wěn)定性，讓您可以上午配液，下午甚至第二天再從容讀數(shù)。

• 痛點二：氣泡殺手，數(shù)據(jù)忽高忽低

 在快速加樣時，液體撞擊液面極易產(chǎn)生氣泡。傳統(tǒng)試劑遇到氣泡，光信號會被折射或遮擋，導致同一次實驗的數(shù)據(jù)變異系數(shù)（CV%）居高不下。ONE-Glo™ 對物理擾動具有免疫力，即使帶有微量氣泡，讀數(shù)依然堅挺。

• 痛點三：怕水又怕臟，基質(zhì)干擾大

 很多實驗需要在含有高濃度血清或特定添加劑的培養(yǎng)基中進行。傳統(tǒng)試劑一旦遇到酚紅或抗氧化劑，發(fā)光信號會被抑制 50% 甚至更多。ONE-Glo™ 擁有高的“抗污"能力，在復雜的培養(yǎng)體系中依然能保持信號的線性響應。

• 痛點四：氣味熏天，通風櫥里都扛不住

 實驗室的通風系統(tǒng)有時候也扛不住劣質(zhì)試劑的惡臭。ONE-Glo™ 的環(huán)保無味配方，讓您可以安心在超凈臺或普通實驗臺上操作，不必時刻屏住呼吸。

• 痛點五：小體積檢測信號弱，蒸發(fā)惹的禍

 在 1536 孔板中，幾微升的試劑眨眼間就會蒸發(fā)變干。ONE-Glo™ 的緩沖體系能有效減緩蒸發(fā)帶來的影響，保證小體積下的信號強度。

第九部分：常見問題與解決方案 (Troubleshooting)

問題一：發(fā)光信號整體偏弱，甚至接近空白背景

• 可能原因： 細胞轉(zhuǎn)染效率過低；螢光素酶表達量本身極低；檢測試劑配制錯誤（如 Buffer 未全溶解底物）；或者細胞數(shù)量過少。

• 解決方案： 優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件（如更換轉(zhuǎn)染試劑、調(diào)整 DNA 與轉(zhuǎn)染試劑比例）；增加細胞接種密度；仔細檢查試劑配制步驟，確保凍干粉全化開；延長加樣后的孵育時間至 10 分鐘后再讀數(shù)。

問題二：實驗組與對照組之間沒有顯著差異（無響應）

• 可能原因： 藥物或刺激因子劑量不足；作用時間不夠；報告基因載體構建有誤（如啟動子序列缺失）；或者細胞系對該通路不敏感。

• 解決方案： 進行藥物的梯度稀釋測試，尋找最佳起效濃度；延長藥物處理時間；重新測序驗證載體的準確性；嘗試使用陽性對照質(zhì)粒（如 pGL3-Control）來確認系統(tǒng)是否正常運作。

問題三：數(shù)據(jù)重現(xiàn)性差，孔間差異極大（CV% > 20%）

• 可能原因： 加樣時產(chǎn)生了大量氣泡且未消除；微孔板震蕩混勻不均勻；細胞在鋪板時分布不均（貼壁細胞聚團）。

• 解決方案： 降低移液器的退吸速度，或使用反向移液法減少氣泡；確保微孔板在振蕩器上放置平穩(wěn)；在鋪板前使用胰酶充分消化細胞，并用移液槍反復吹打制成真正的單細胞懸液。

問題四：標準曲線線性關系變差

• 可能原因： 螢光素酶濃度過高，發(fā)生了底物耗盡（Substrate depletion）；或者檢測試劑過期失效。

• 解決方案： 對高表達的樣本進行梯度稀釋后重測；在檢測高濃度樣本時，適當增加 ONE-Glo™ Reagent 的加入量；檢查試劑的有效期及儲存溫度。

問題五：背景孔（Blank）讀數(shù)異常偏高

• 可能原因： 微孔板潔凈度不夠，有還原性物質(zhì)殘留；發(fā)光檢測儀的光路系統(tǒng)受到污染；或者 Buffer 受到熒光素酶的污染。

• 解決方案： 使用全新的無菌微孔板；定期清潔和維護讀板機；確保 ONE-Glo™ 試劑瓶瓶口潔凈，取用后立即封口。

問題六：不同批次試劑之間存在系統(tǒng)誤差

• 可能原因： 不同批次間的底物活性存在微小統(tǒng)計學波動；或者實驗操作人員發(fā)生了變動。

• 解決方案： 在進行跨批次的大規(guī)模篩選實驗時，務必在各批次中加入相同的質(zhì)控品（Control），以便在后期數(shù)據(jù)分析時進行歸一化處理。

問題七：試劑在低溫下出現(xiàn)結晶或沉淀

• 可能原因： ONE-Glo™ Buffer 中含有高濃度的鹽類或緩沖成分，在低溫冷凍下溶解度下降，屬于正常的物理現(xiàn)象。

• 解決方案： 將試劑瓶取出，置于室溫下自然回溫，并輕輕搖晃，待結晶全溶解、溶液變澄清后即可正常使用，不影響性能。

問題八：讀數(shù)時出現(xiàn)明顯的雙峰或信號延遲

• 可能原因： 發(fā)光檢測儀的參數(shù)設置不當（如延遲時間 Delay Time 設置過長或過短）；或者裂解過程不徹。

• 解決方案： 優(yōu)化儀器參數(shù)，通常 Delay Time 設為 0 或 1 秒，Integration Time 設為 0.5 至 1 秒；延長微孔板的搖勻時間，確保細胞充分裂解。

問題九：細胞在加樣后大量漂浮或脫壁

• 可能原因： ONE-Glo™ 試劑中的去污劑濃度對某些極度脆弱的細胞系（如原代神經(jīng)元細胞、懸浮淋巴細胞）來說略高，導致膜結構瞬間崩解。

• 解決方案： 嘗試用無血清培養(yǎng)基 1:1 稀釋 ONE-Glo™ Reagent 后再加入孔中；或者在加樣前先棄去大部分培養(yǎng)基，保留極少量液體作為緩沖。

問題十：長時間（>2小時）孵育后信號急劇下降

• 可能原因： 雖然 ONE-Glo™ 穩(wěn)定性佳，但在高溫（>30°C）環(huán)境下，或者底物濃度被極度稀釋時，仍可能發(fā)生緩慢降解。

• 解決方案： 盡量在室溫（20-25°C）環(huán)境下進行操作；如果需要極長的孵育時間，建議分批上機檢測，每次只拿出當前要測的板子。

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