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熒光二抗的選擇——Dylight熒光與傳統(tǒng)熒光標(biāo)記的比較

更新時(shí)間:2012-09-13      點(diǎn)擊次數(shù):4627

顧名思義,熒光二抗通常指代的就是帶熒光團(tuán)標(biāo)記的二抗,這樣的二抗可以通過(guò)觀察其在不同波長(zhǎng)下熒光的強(qiáng)度來(lái)確定其二抗的含量。常見(jiàn)的熒光團(tuán)包括FITC、Rhodamine、Texas Red、PE、Cy系列等。比如FITC即異硫氰酸熒光素,是目前應(yīng)用zui廣泛的熒光素。zui大吸收光波長(zhǎng)為490~495nm,zui大發(fā)射光波長(zhǎng)為 520~530nm,呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光。其優(yōu)勢(shì)是分子量較小為389.4,每一個(gè)抗體可標(biāo)記幾個(gè)FITC分子,而且人眼對(duì)黃綠色較為敏感,因此具有很好的對(duì)比度其缺點(diǎn)是淬滅快。羅丹明(Rhodamin)及其衍生物則是一群帶黃紅色熒光的熒光素,包括TRITC、Texas Red等。羅丹明及其衍生物與FITC的綠色熒光對(duì)比鮮明,可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧R蚱錈晒獯銣缏部捎糜趩为?dú)標(biāo)記染色,但是其熒光強(qiáng)度偏弱,其中Rhodamin比Texas Red熒光又要偏弱。艾美捷能為客戶(hù)提供全系列的各種*熒光二抗,包括Jackson的大包裝粉末形式的熒光二抗,另外,也提供EarthOx的小包裝液體形式熒光二抗,均具有很高的性?xún)r(jià)比。更多二抗產(chǎn)品,請(qǐng)查看:艾美捷二抗產(chǎn)品

 

花箐素Cy是另一類(lèi)熒光團(tuán),包括綠色的Cy2、黃紅色的Cy3、紅色的Cy5、近紅外的Cy5.5等熒光染料,由于結(jié)構(gòu)的稍微區(qū)別,其吸收和發(fā)射波長(zhǎng)也有所區(qū)別。比如Cy2耦聯(lián)基團(tuán)激發(fā)波長(zhǎng)為492nm,發(fā)光為波長(zhǎng)510nm的綠色可見(jiàn)光。Cy2和FITC使用相同的濾波片,但是要避免使用含有磷酸化的苯二胺的封片劑,因?yàn)檫@種抗淬滅劑和Cy2反應(yīng),在染色片儲(chǔ)存后會(huì)導(dǎo)致熒光微弱和擴(kuò)散。Cy3和Cy5比其他的熒光團(tuán)探針要更亮,更穩(wěn)定,背景更弱。Cy3耦聯(lián)基團(tuán)激發(fā)光的zui大波長(zhǎng)為550nm,zui強(qiáng)發(fā)射光為570nm。因?yàn)榧ぐl(fā)光和發(fā)射光波長(zhǎng)很接近TRITC, 在熒光顯微鏡中,可使用和TRITC一樣的濾波片。Cy5可以和很多其他的熒光基團(tuán)一起用在多標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)中。由于它的zui大發(fā)射波長(zhǎng)在670nm,Cy5很難用裸眼觀察,而且不能用汞燈作理想的激發(fā)。通常觀察Cy5時(shí)采用具有合適激發(fā)光和遠(yuǎn)紅外檢測(cè)器的共聚焦顯微鏡。下面我們看一組熒光二抗的比照?qǐng)D片:

 

Dylight熒光二抗      dylight-2.jpg

 

我們知道,F(xiàn)ITC的綠色熒光強(qiáng)度肉眼觀察已經(jīng)很亮了,但是從左上面的圖可見(jiàn),與Cy2相比還是偏弱,而Dylight 488則更勝*;右上圖是不同熒光團(tuán)在含有90%甘油的PBS里的熒光淬滅情況,由圖可見(jiàn)。FITC的淬滅都很快,Cy2其次,而Dylight 488和Alexa 488都具有很好的光穩(wěn)定性。下面再看另一組有關(guān)于紅色熒光的數(shù)據(jù):

 

dylight-3.jpgdylight-4.jpg

 

由左上圖可見(jiàn),Dylight 594比Alexa 594和Texas Red的熒光強(qiáng)度都要強(qiáng),Dylight 594的特異性也很好;同樣,右上圖顯示Dylight 594的光穩(wěn)定性也很優(yōu)異。那么Dylight到底是一種什么樣的熒光團(tuán)?不管在結(jié)構(gòu)以及功能和應(yīng)用上,Dylight都是一種新的熒光團(tuán),與傳統(tǒng)的熒光團(tuán)相比,其分子量相對(duì)較小,因此一個(gè)大分子上可以標(biāo)記更多的Dylight,同時(shí)單個(gè)的Dylight熒光團(tuán),其熒光強(qiáng)度更強(qiáng),特異性更好;Dylight對(duì)光更穩(wěn)定,這意味著其具有更高的抗淬滅性,不像FITC因?yàn)榭焖侔l(fā)生淬滅而無(wú)法及時(shí)捕捉到熒光圖像。Dylight還有一個(gè)優(yōu)勢(shì)是種類(lèi)很全,比如做三標(biāo)的時(shí)候,除了常見(jiàn)的紅色和綠色熒光,藍(lán)色熒光應(yīng)該是第三選擇,Dylight 405就是藍(lán)色的。Dylight 488是綠色的,可*替代FITC;*替代Cy3和Rhodamin的Dylight 549;替代Texas Red的Dylight 594;Dylight 633和Dylight 649則是更強(qiáng)的紅色熒光;另外,Dylight還有適配Odyssey系統(tǒng)的近紅外和遠(yuǎn)紅外二抗,分別是Dylight 680和Dylight 800。

 

可能還需要考慮的一個(gè)問(wèn)題是價(jià)格的問(wèn)題,其實(shí)Dylight的熒光二抗與常規(guī)熒光二抗相比,具有更高的性?xún)r(jià)比,一般來(lái)說(shuō),Dylight的價(jià)格比常規(guī)二抗只高20%左右,但是Dylight的效價(jià)通常是常規(guī)熒光二抗的2-4倍左右,因此就zui終的性?xún)r(jià)比,Dylight更勝*。舉例來(lái)說(shuō),EarthOx的FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗(貨號(hào)為E031210),100μl是¥160;而相應(yīng)的EarthOx的Dylight 488標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗(貨號(hào)為E032210),100μl報(bào)價(jià)是¥240,但是在具體使用時(shí),比如免疫熒光實(shí)驗(yàn),其推薦稀釋比率分別為1:100和1:400,即100μl的FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG二抗(貨號(hào)為E031210)zui終使用液是10ml,而100μl的Dylight 488標(biāo)記山羊抗小鼠IgG二抗(貨號(hào)為E032210)zui終使用液是40ml,可見(jiàn),即使不考慮Dylight更高的熒光強(qiáng)度、更好的光學(xué)穩(wěn)定性和特異性,但就價(jià)格來(lái)說(shuō),Dylight熒光二抗也具有更高的性?xún)r(jià)比。

 

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