genebridges K006說(shuō)明書(shū)

Quick & Easy E.coli Gene Deletion Kit

快速簡(jiǎn)便的大腸桿菌基因刪除試劑盒

用于快速敲除或修飾大腸桿菌染色體上的基因。

特征

• Red / ET的忠實(shí)重組
• 快速準(zhǔn)確
• 可能有多個(gè)淘汰賽
• 方便地去除重組質(zhì)粒

應(yīng)用領(lǐng)域

• 該試劑盒旨在在不到一周的時(shí)間內(nèi)敲除或改變大腸桿菌染色體上的基因

大腸桿菌染色體上基因的靶向破壞

1.轉(zhuǎn)化用表達(dá)質(zhì)粒pRedET轉(zhuǎn)化將被修飾
的大腸桿菌菌株。

2. Red / ET重組
Red / ET表達(dá)是通過(guò)添加L-阿拉伯糖和溫度變化來(lái)誘導(dǎo)的。含有50 bp同源臂的FRT-PGK-gb2-neo-FRT盒被轉(zhuǎn)化。Red / ET介導(dǎo)的重組通過(guò)插入盒帶破壞了靶基因座。

3.可選：去除選擇標(biāo)記
Flp介導(dǎo)的切除，僅留下一個(gè)FRT部位。（另請(qǐng)參見(jiàn)我們的FRT選擇盒和Flp表達(dá)質(zhì)粒和菌株）。

描述

Red / ET重組使堿基對(duì)可以準(zhǔn)確，特異性和忠實(shí)的方式交換遺傳信息。試劑盒隨附有FRT側(cè)翼的卡那霉素抗性標(biāo)記盒，可用于替換大腸桿菌染色體上的基因。Red / ET重組可替代大腸桿菌染色體上長(zhǎng)達(dá)30kb的片段。如果需要，使用FRT側(cè)翼抗性盒替代靶基因可以隨后通過(guò)FLP重組酶步驟去除選擇標(biāo)記。FLP表達(dá)質(zhì)粒可以從Gene Bridges購(gòu)買(mǎi)。通過(guò)重復(fù)插入試劑盒附帶的功能盒或與Gene Bridges提供的其他功能盒組合，可以產(chǎn)生多個(gè)基因敲除。重組過(guò)程由于pRedET表達(dá)質(zhì)粒的優(yōu)化設(shè)計(jì)而受到嚴(yán)格控制。重組蛋白的基因在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下，質(zhì)粒帶有溫度敏感的復(fù)制起點(diǎn)，可在重組后方便地去除質(zhì)粒。

內(nèi)容

• 兩個(gè)Red / ET重組蛋白表達(dá)質(zhì)粒pRedET（tet）和pRedET（amp）。通過(guò)用這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，可以使任何大腸桿菌菌株變成Red / ET熟練的。
• FRT位于卡那霉素抗性模板的側(cè)面（FRT-PGK-gb2-neo-FRT），可用于您自己的實(shí)驗(yàn)。
• 替代大腸桿菌染色體上甘露糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（manX）基因的陽(yáng)性對(duì)照。
• 詳細(xì)的協(xié)議，質(zhì)粒，圖譜和序列的描述。

順序

FRT-PGK-gb2-neo-FRT

AATTAACCCTCACTAAAGGGCGGCCGC GAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGG AACTTC ATT CTACCGGGTAGGGGAGGCGCTTTTCCCAAGGCAGTCTGGAGCATGC GCTTTAGCAGCCCCGCTGGGCACTTGGCGCTACACAAGTGGCCTCTGGCCTCGCA CACATTCCACATCCACCGGTAGGCGCCAACCGGCTCCGTTCTTTGGTGGCCCCTT CGCGCCACCTTCCACTCCTCCCCTAGTCAGGAAGTTCCCCCCCGCCCCGCAGCTC GCGTCGTGCAGGACGTGACAAATGGAAGTAGCACGTCTCACTAGTCTCGTGCAGA TGGACAGCACCGCTGAGCAATGGAAGCGGGTAGGCCTTTGGGGCAGCGGCCAATA GCAGCTTTGCTCCTTCGCTTTCTGGGCTCAGAGGCTGGGAAGGGGTGGGTCCGGG GGCGGGCTCAGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGGCGGGCGCCCGAAGGTCCTCCGGAG GCCCGGCATTCTGCACGCTTCAAAAGCGCACGTCTGCCGCGCTGTTCTCCTCTTC CTCATCTCCGGGCCTTTCGACCTGCAGCAGCACGTGTTGACAATTAATCATCGGC ATAGTATATCGGCATAGTATAATACGACAAGGTGAGGAACTAAACCATGGGATCG GCCATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGC TATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACGATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTT CCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGT GCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGG GCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCT GCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCC GAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGG CTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCG GATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTC GCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATC TCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCG CTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGAC ATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACC GCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTA TCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAATAAAGACCGA CCAAGCGACGTCTGA GAGCTCCCTGGCGAATTCGGTACCAATAAAAGAGCTTTAT TTTCATGATCTGTGTGTTGGTTTTTGTGTGCGGCGCG GAAGTTCCTATTCTCTAG AAAGTATAGGAACTTC CTCGAGCCCTATAGTGAGTCGTATTA